James Marsden iniciou sua carreira como ator ao se mudar para Los Angeles para seguir o interesse pela atuação. Seu primeiro trabalho foi no episódio piloto de The Nanny (1993), como Eddie, o namorado de Margaret Sheffield. Em seguida, fez parte da série de televisão canadense Boogies Diner (1994), que foi ao ar por uma temporada. Após o término dessa série, conseguiu um breve papel como o Griffin original na série Party of Five (1994), da Fox. Seu primeiro grande avanço veio quando se tornou o protagonista da série de curta duração da ABC, Second Noah (1996). Embora o programa não tenha durado muito, o jovem ator recebeu exposição suficiente do público e até conquistou o coração de garotas adolescentes. Em 1996, ele participou de uma audição para o filme Primal Fear (1996), mas infelizmente perdeu o papel para Edward Norton. Dois anos depois, foi oferecido a ele um papel principal em 54 (1998), que ele recusou. O papel mais tarde foi para outro ator, Ryan Phillippe.

O poder de estrela de James aumentou quando ele estrelou Disturbing Behavior (1998), de David Nutter, ao lado de Katie Holmes e Nick Stahl, que recebeu críticas mistas, mas em sua maioria positivas. Seu papel na série de televisão como Glenn Foy em Ally McBeal (1997) é provavelmente uma de suas maiores conquistas até hoje. Ele se tornou um dos membros principais do elenco durante a primeira metade da 5ª temporada, onde mostrou suas habilidades de canto. Foi nesse programa que ele conseguiu chamar a atenção de públicos de diferentes origens. Mais tarde, ele interpretou Lon Hammon Jr. no filme romântico The Notebook (2004), baseado no romance de mesmo nome de Nicholas Sparks. Seus filmes The Alibi (2006) e 10th & Wolf (2006) também foram lançados mundialmente para o público no ano de 2006. Um de seus papéis mais memoráveis para os fãs é o de Ciclope na franquia de filmes X-Men (2000). O filme foi bem aceito pelo público e pela crítica, o que eventualmente tornou James uma das estrelas mais badaladas desde seu lançamento. Ele estava entre os atores que estrelaram todos os três filmes X-Men. James teve a honra de trabalhar ao lado de Patrick Stewart, Famke Janssen e Hugh Jackman no filme. No entanto, não muitas pessoas sabem que ele teve que usar saltos para a maioria de suas cenas nos filmes X-Men, porque seu personagem Ciclope deveria ter 1,90 m em comparação com um Wolverine de 1,60 m. Na realidade, ele tem menos de 1,83 m, mais baixo que Famke Janssen, que interpreta seu interesse amoroso, Jean Grey, e até mais baixo que Hugh Jackman, que interpretou Wolverine.

No ano de 2006, ele interpretou Richard White no aguardado filme Superman Returns (2006), que coincidentemente foi dirigido por Bryan Singer, que também dirigiu os filmes anteriores de X-Men. Embora tenha aparecido em X-Men: The Last Stand (2006), o terceiro filme da franquia X-Men, muitos notariam que ele na verdade teve mais tempo de tela em Superman Returns, como o noivo de longa data de Lois Lane, que teve que aceitar o fato de que sua noiva está apaixonada pelo Homem de Aço. James recebeu ótimas críticas por esse filme, o que o levou a conseguir mais papéis no cinema. Em 2007, James interpretou Corny Collins no filme Hairspray (2007), uma adaptação do musical da Broadway baseado no filme de John Waters, Hairspray (1988). Ele se juntou a um elenco estelar, atuando ao lado de grandes nomes como John Travolta, Queen Latifah e Michelle Pfeiffer. James não apenas atuou nesse filme, mas também cantou duas das músicas do filme, "The Nicest Kids In Town" e "Hairspray". Fazer parte de Hairspray catapultou James para um nível diferente de estrelato, à medida que o público pôde ver outro lado dele. Seu próximo papel foi no filme da Disney, Enchanted (2007), interpretando o Príncipe Edward, onde atuou ao lado de Amy Adams, Susan Sarandon e Patrick Dempsey. Mais uma vez, James teve a oportunidade de cantar em duas músicas do filme, "True Love's Kiss" e "That's Amore". Enchanted (2007) atraiu não apenas o público mais velho, mas também os fãs das produções da rede Disney. Após seu enorme sucesso nos anos de 2006 e 2007, James interpretou o papel masculino principal na comédia romântica 27 Dresses (2008), ao lado da atriz Katherine Heigl em 2008. O filme se saiu bem nas bilheterias, arrecadando mais de US$ 159 milhões, o que superou as expectativas dos membros da equipe, especialmente porque tinha um orçamento inferior a US$ 30 milhões.

Marsden interpretou o papel masculino principal no filme de terror The Box (2009), baseado no conto de 1970 "Button, Button", do autor Richard Matheson. Ele estrelou ao lado de Cameron Diaz no filme.

Ele co-estrelou Accidental Love (2015) (anteriormente Accidental Love (2015)), uma comédia romântica de temática política, dirigida por David O. Russell e filmada em Columbia, Carolina do Sul. Os papéis recentes de Marsden no cinema incluem a comédia sequência Anchorman 2: The Legend Continues (2013), o drama romântico The Best of Me (2014) e a comédia Unfinished Business (2015).

Muitos presumiriam que, com todo esse sucesso alcançado por James nessa idade, ele seria um tanto arrogante, mas James mencionou que, apesar de toda a atenção que recebe do olhar do público, ele tenta se manter o mais pé no chão possível. Ele até admite que voa na classe econômica em vez da primeira classe enquanto viaja. Em uma entrevista, ele mencionou que acredita ter uma certa responsabilidade de deixar claro que não é especial pelo que faz, mas pelo que é como pessoa. Com uma ótima atitude humilde e um futuro brilhante pela frente, definitivamente há mais a se esperar deste nativo de Oklahoma.