Julia Stiles iniciou sua trajetória artística ao ser incentivada a fazer aulas de dança moderna, sendo apresentada a Shakespeare e ao teatro desde muito cedo. Aos 11 anos, fez sua estreia nos palcos como atriz infantil no experimental teatro off-Broadway La MaMa Theatre. Sua paixão cresceu e, no ano seguinte, já se apresentava profissionalmente e trabalhava em comerciais. Estudante brilhante e precoce, foi seriamente considerada para o papel da vampira criança Claudia em Interview with the Vampire: The Vampire Chronicles (1994), mas perdeu a oportunidade para Kirsten Dunst. Continuou seu treinamento na Professional Children's School de Nova York e, aos 15 anos, fez sua estreia no cinema com I Love You, I Love You Not (1996), ao lado de Claire Danes.

Julia foi em seguida destaque como a filha de Harrison Ford em The Devil's Own (1997), com seu papel de maior visibilidade ocorrendo na TV com o impactante telefilme Before Women Had Wings (1997), produzido por Oprah Winfrey e que tratava de abuso infantil. Seu desejo de atuar em Shakespeare foi realizado de três formas com sua participação em 10 Things I Hate About You (1999), baseado em "The Taming of The Shrew" do Bardo e que lhe rendeu o Chicago Film Critics Award como a volátil adolescente Kat; uma versão atualizada de Hamlet (2000), que uniu sua Ofélia a Ethan Hawke; e outra versão atualizada de "Othello" intitulada O (2001), que envolvia sua personagem colegial Desi (Desdemona) em um relacionamento romântico misto com o afro-americano Mekhi Phifer. O filme de tom violento, feito em 1998, só foi lançado três anos depois devido ao massacre na Columbine High School, no Colorado.

Além disso, Julia mais tarde interpretou Viola off-Broadway em uma produção Shakespeare-in-the-Park de "Twelfth Night" em 2002. Ela interrompeu temporariamente sua carreira após decidir se matricular na Columbia University em 2000, onde obteve um diploma em Inglês. Stiles também retornou aos palcos, aparecendo em "Oleanna" de David Mamet em Londres, papel que reprisaria na Broadway em 2009, ao lado de Bill Pullman e dirigida por Doug Hughes.

Passando para papéis mainstream na virada do milênio, Julia assumiu um papel que a acompanharia ao longo da década, coestrelado com Matt Damon na popular série Bourne: The Bourne Identity (2002), The Bourne Supremacy (2004) e The Bourne Ultimatum (2007). No intervalo entre os filmes Bourne, ela apareceu em dramas de ensemble, contracenando com Julia Roberts em Mona Lisa Smile (2003), e chamou atenção de forma peculiar no papel-título de Carolina (2003), com Shirley MacLaine e Randy Quaid. Ela também retornou às suas raízes no cinema independente, com filmes como Between Us (2012) e a comédia farsesca It's a Disaster (2012).

Em 2010, Julia mudou de direção e foi para a televisão seriada, entrando para o elenco de Dexter (2006) na quinta temporada como Lumen Pierce, atuação que lhe rendeu indicações ao Emmy e ao Golden Globe. Em 2012, ela seguiu com papéis principais em duas outras séries de TV, o drama social Blue (2012) e o thriller dramático Riviera (2017).

Suas filmagens mais recentes incluíram papéis de destaque em The Great Gilly Hopkins (2015), Misconduct (2016), Jason Bourne (2016), Trouble (2017), Hustlers (2019) e The God Committee (2021).