Julia Stiles fue introducida a Shakespeare y al teatro a una edad temprana, alentada a tomar clases de danza moderna. A los 11 años, hizo su debut teatral como actriz infantil en el experimental teatro off-Broadway La MaMa Theatre. Su pasión creció y para el año siguiente ya actuaba profesionalmente y trabajaba en comerciales. Una estudiante brillante y precoz, fue considerada seriamente para el papel de la niña vampiro Claudia en Interview with the Vampire: The Vampire Chronicles (1994), pero finalmente perdió el papel ante Kirsten Dunst. Continuó su formación en la Professional Children's School de Nueva York y, a los 15 años, hizo su debut cinematográfico con I Love You, I Love You Not (1996) junto a Claire Danes.

Julia apareció luego como la hija de Harrison Ford en The Devil's Own (1997), y su papel revelación llegó en televisión con la impactante minipelícula Before Women Had Wings (1997), producida por Oprah Winfrey y que trataba sobre el abuso infantil. Su deseo de interpretar a Shakespeare se cumplió por triplicado con su participación en 10 Things I Hate About You (1999), basada en "The Taming of The Shrew" del Bardo y que le valió el Chicago Film Critics Award por su volátil adolescente Kat; una versión actualizada de Hamlet (2000) que emparejó a su Ofelia con Ethan Hawke; y otra versión actualizada de "Othello" titulada O (2001), que involucró a su personaje de secundaria Desi (Desdemona) en una relación romántica mixta con el afroamericano Mekhi Phifer. La película de tono violento, rodada en 1998, no se estrenó hasta tres años después debido al tiroteo de Columbine High School en Colorado.

Además, Julia interpretó más tarde a Viola off-Broadway en una producción de Shakespeare-in-the-Park de "Twelfth Night" en 2002. Interrumpió temporalmente su carrera tras decidir matricularse en la Universidad de Columbia en 2000, donde obtuvo un título en Inglés. Stiles también ha regresado a los escenarios, apareciendo en "Oleanna" de David Mamet en Londres, papel que repetiría en Broadway en 2009, junto a Bill Pullman y dirigida por Doug Hughes.

Pasando a papeles más comerciales en el cambio de milenio, Julia asumió un papel que la acompañaría durante la década, coprotagonizando con Matt Damon la popular saga Bourne: The Bourne Identity (2002), The Bourne Supremacy (2004) y The Bourne Ultimatum (2007). Entre las películas de Bourne, apareció en dramas corales, actuando junto a Julia Roberts en Mona Lisa Smile (2003), y llamó la atención por su papel protagonista en Carolina (2003) con Shirley MacLaine y Randy Quaid. También regresó a sus raíces en el cine independiente, con películas como Between Us (2012) y la comedia farsa It's a Disaster (2012).

En 2010, Julia cambió de rumbo y se pasó a la televisión seriada, uniéndose al reparto de Dexter (2006) para la quinta temporada como Lumen Pierce, una actuación que le valió nominaciones a los Emmy y a los Globos de Oro como actriz de reparto. En 2012, continuó con papeles protagonistas en otras dos series de televisión, el drama social Blue (2012) y el thriller dramático Riviera (2017).

Su trabajo más reciente en el cine ha incluido papeles destacados en The Great Gilly Hopkins (2015), Misconduct (2016), Jason Bourne (2016), Trouble (2017), Hustlers (2019) y The God Committee (2021).